圖解中國藥典控制菌檢查法（二）
 

　　方法適用性試驗
 

　　試驗菌：根據供試品所需檢查的控制菌選擇相應試驗菌株，確認耐膽鹽革蘭陰性菌檢查方法時，采用大腸埃希菌和銅綠假單胞菌為試驗菌。
 

　　依相應的控制菌檢查方法，在規定的溫度和最短時間下培養，應能檢出相應控制菌。
 

　　若未檢出試驗菌，應消除供試品的抑菌活性[見非無菌產品微生物限度檢查：微生物計數法(通則1105)中的“抗菌活性的去除或滅活”]，并重新進行方法適用性試驗。
 

　　如果經過試驗確證供試品對試驗菌的抗菌作用無法消除，可認為受抑制的微生物不易存在于該供試品中，選擇抑菌成分消除相對*的方法進行供試品的檢查。
 

　　
 

　　供試品檢查
 

　　供試品的控制菌檢查應按經方法適用性試驗確認的方法進行。
 

　　陽性對照：對照菌的加量應不大于100cfu，應檢出相應的控制菌。【耐膽鹽革蘭陰性菌檢查中的陽性對照株使用大腸埃希菌或銅綠假單胞菌；梭菌檢查中的陽性對照株使用生孢梭菌】
 

　　陰性對照：以稀釋劑代替供試液，應無菌生長。如果有菌生長，應進行偏差調查。
 

　　
 

　　3.1耐膽鹽革蘭陰性菌（Bile-Tolerant Gram-Negative Bacteria)
 

　　簡述：耐膽鹽革蘭陰性菌是指能夠耐受膽鹽，在紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養基中生長的革蘭陰性桿菌，一般包括腸桿菌科、假單胞菌屬、氣單胞菌屬等。其作為衛生指標，與大腸菌群有類似的指示作用。對于非無菌產品而言，檢出耐膽鹽革蘭陰性菌或超標，指示生產工藝存在缺陷、原輔料受到污染、生產、儲運緩解微生物污染控制措施失效等。
 

　　在紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養基中生長的革蘭陰性桿菌
 

　　根據標準規定選擇定性或定量方法。若標準規定為“不得檢出耐膽鹽革蘭陰性菌”，則選擇“定性試驗”檢驗；若標準規定為“耐膽鹽革蘭陰性菌應<10n cfu/g(ml)”，則選擇“定量試驗”檢驗。
 

　　試驗步驟如下圖：
 

　　通過選擇性增菌，紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養基中生長的菌應為革蘭陰性菌，但仍需進行革蘭染色進行確認。
 

　　陽性對照試驗使用大腸埃希菌或銅綠假單胞菌，并在接種EE的步驟加入對照菌。
 

　　培養基：
 

　　3.2大腸埃希菌（Escherichia coli）
 

　　簡述：大腸埃希菌為腸桿菌科埃希菌屬的模式種。大腸埃希菌是人和溫血動物腸道內的棲居菌，隨糞便排出體外。在藥品中檢出大腸埃希菌，表明該樣品受到人和溫血動物的糞便污染，即可能污染腸道病原體。除普通大腸埃希菌外，尚有致病性大腸埃希菌，可引起嬰幼兒、成人爆發性腹瀉。為保證人體健康，口服藥品必須檢查大腸埃希菌。
 

　　試驗步驟如下圖：

 

　　大腸埃希菌檢查應鑒定到“種”水平。
 

　　麥康凱液體的培養溫度為42~44℃，因為該條件是區分大腸埃希菌和大腸菌群其他“種”的關鍵條件，另外有文獻報道表明：受到人和溫血動物糞便污染的大腸埃希菌在42~44℃更容易生長。
 

　　大腸埃希菌在麥康凱瓊脂中的典型菌落形態特征：鮮桃紅色或微紅色，菌落中心呈深桃紅色，圓形，扁平，邊緣整齊，表面光滑，濕潤。
 

大腸埃希菌在麥康凱瓊脂上
 

　　結果與判定：MUG和靛基質試驗可以作為確認的參考方法。IMViC試驗亦可以作為鑒定和確認的參考。
 

　　培養基：
 

 

　　3.3沙門菌（Salmonella）
 

　　簡述：沙門菌屬是腸桿菌科的重要致病菌。在沙門菌的分類學研究和流行病學研究中，按照血清型進行分類更為常見，一般來說，O抗原抗血清的A-E群包含了沙門菌分離株的95%，所以可以用沙門菌A-F O多價血清進行沙門菌初篩試驗。
 

　　試驗步驟如下圖：

 

藥品中的沙門菌，是以鑒定沙門菌屬為準。
 

　　與其他控制菌相比，沙門菌檢查的取樣量較大(10g或10mL的供試品)，經方法適用性試驗，可適當增加TSB的體積，消除可能的抑菌作用。
 

　　使用RV培養基應控制預增菌液的加入量，一般要求1:100 ~1:2000之間。
 

　　沙門菌在XLD中典型菌落為淡紅色或無色、透明或半透明、中心有或無黑色。使用XLD時需注意：①培養超過48h可能造成某些微生物的假陽性；②某些變形桿菌菌株可能會出現黑心菌落；③甲型副傷寒沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌、雞白痢沙門氏菌及雞傷寒沙門氏菌可能會形成無黑心紅色菌落，與志賀氏菌混淆。
 

　　在TSI高層斜面試驗中，建議同時接種沙門菌、大腸埃希菌或其他類似腸桿菌科的標準菌株作為對照菌，輔助判斷斜面和底層的顏色反應。
 

　　沙門菌利用培養基中的葡萄糖產酸使斜面先變黃，生成的少量酸接觸空氣氧化，同時利用培養基中含氮物質，生成堿性產物，使斜面變紅。底層在缺氧狀態下，細菌分解葡萄糖生成的酸類一時不被氧化而仍保持黃色。
 

　　培養基：
 

　　3.4銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）
 

　　簡述：銅綠假單胞菌為假單胞菌屬菌種，本菌是常見的化膿性感染菌，在燒傷、燙傷、眼科及其他外科疾患中常引起繼發感染，優于本菌對許多抗菌藥物具有天然的耐藥性，增加了治療的難度，國內外藥典均將銅綠假單胞菌檢查被列為外用制劑的檢查項目之一。
 

　　試驗步驟如下圖：
 

 

　　銅綠假單胞菌檢查應鑒定到“種”水平。
 

　　溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養基(以下簡稱“CA”)上若有菌生長，均需要鏡檢鑒定。典型的銅綠假單胞菌在CA上形成藍綠色菌落，在254nm的紫外燈下顯熒光；有個別株不產綠膿菌素，但在254nm的紫外燈下仍顯熒光。
 

　　銅綠假單胞菌在CA上

 

　　若需要進一步進行適宜的鑒定試驗，可以進行綠膿菌素試驗、硝酸鹽還原產氣試驗、42℃生長試驗和明膠液化試驗，判定如下圖。
 

 

培養基： 

 

　　3.5金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
 

　　簡述：金黃色葡萄球菌為葡萄球菌屬中的一種。本菌可產生多種毒素及酶，這些毒性物質能引起局部及全身化膿性炎癥，嚴重時可發展成為敗血癥和膿毒血癥，是人類化膿性感染中重要的病原菌。金黃色葡萄球菌檢查是外用制劑的檢查項目之一。
 

　　試驗步驟如下圖：
 

 

　　金黃色葡萄球菌檢查應鑒定到“種”水平。
 

　　典型的金黃色葡萄球菌在MSA上呈黃色菌落或外周有黃色環的白色菌落，而表皮葡萄球菌則能使培養基呈紅色。菌落呈黃色表示該菌很可能血漿凝固酶呈陽性，而菌落呈紅色則表示血漿凝固酶呈陰性。
 

　　除MSA外，還可以將疑似菌落劃線至Baird-Parker平板和血平板上。金黃色葡萄球菌在Baird-Parker平板上呈圓形，表面光滑、凸起、濕潤、菌落直徑為2~3mm，顏色呈灰黑色至黑色，有光澤，常有淺色(非白色)的邊緣，周圍繞以不透明圈(沉淀)，其外常有一清晰帶。在血平板上，形成菌落較大，圓形、光滑凸起、濕潤、金黃色(有時為白色)，菌落周圍可見*透明溶血圈。
 

　　確證的關鍵試驗為血漿凝固酶試驗，注意需同時進行陽性對照(金黃色葡萄球菌菌懸液)和陰性對照試驗(空白培養液或稀釋液)。
 

　　選擇性平板上為典型菌落，革蘭陽性球菌，血漿凝固酶試驗陽性，則判檢出金黃色葡萄球菌。

 

金黃色葡萄球菌在甘露醇氯化鈉瓊脂培養基上
 

　　培養基：
 

　　3.6梭菌（Clostridia）
 

　　簡述：梭菌屬主要病原菌有：產氣莢膜梭菌、破傷風梭菌、肉毒梭菌和艱難梭菌等，均能產生強烈的外毒素使人和動物治病。因此對于某些用于陰道、創傷、潰瘍的藥品，必須控制梭菌。
 

　　試驗步驟如下圖：

 

　　梭菌檢查需鑒別到“屬”水平。
 

　　梭菌屬細菌芽孢體對外界的抵抗力強，耐高溫耐干燥，對新霉素、卡拉霉素、慶大霉素等抗生素不敏感。因此將供試液在80℃保溫10分鐘后迅速冷卻，以殺死可能存在的雜菌繁殖體，使梭菌具有優勢生長；或在哥倫比亞瓊脂培養基中加入慶大霉素，抑制雜菌，利于梭菌的分離培養。
 

　　梭菌革蘭染色鏡檢的典型形態特征為：培養后形成的芽孢，初呈“火柴頭”狀卵圓形，繼而膨大呈球形，在菌體末端如鼓槌狀。培養72小時以上時，菌體可自溶而消失，僅見游離的芽孢囊，一般染色時呈圓圈狀。染色鏡檢有卵圓形至球形的芽孢，大于菌體，著生于菌體中央、次端或頂端，為梭菌典型形態。
 

　　鑒別梭菌的關鍵生化反應為過氧化氫酶試驗，梭菌應呈陰性(無氣泡形成)，可用枯草芽孢桿菌作為陽性對照(有氣泡形成)。
 

　　培養基：

 

　　簡述：白色念珠菌又名白假絲酵母菌，屬假絲酵母菌屬。白色念珠菌是條件致病菌，是醫學全身性真菌感染病的重要組成之一，一旦感染，?？梢鹦膬饶ぱ?、肺炎、尿布疹、鵝口瘡、陰道炎、腦膜炎及敗血癥等。白色念珠菌廣泛分布于土壤、水和空氣中，目前國內外藥品、食品標準已把白色念珠菌作為微生物檢驗中酵母菌的代表均，因此有些藥品依據給藥途徑和劑型將白色念珠菌作為控制菌是非常必要的。
 

　　試驗步驟如下圖：
 

　　白色念珠菌檢查應鑒定到“種”水平。
 

　　白色念珠菌在SDA中呈乳白色，偶見淡黃色，表面光滑，有濃酵母氣味，培養時間稍久則菌落增大，顏色變深、質地變硬或有褶皺。
 

         培養基：

 

 

　　a.如果陽性對照試驗中陽性菌未生長，則表明檢驗方法或檢驗過程存在干擾因素，應判斷無效，并進行偏差調查，調查的因素包括培養基的配制、滅菌、培養基的適用性檢查、試驗器具的滅菌、檢驗的潔凈環境、人員操作、方法適用性試驗等。
 

　　b.如果陰性對照試驗有菌生長，表明試驗過程存在污染可能，試驗結果無效，應進行偏差調查，調查的因素包括培養基的配制、滅菌、試驗器具的滅菌、檢驗的潔凈環境、人員操作等。
 

　　c.在檢驗過程中，發現有控制菌或不可接受微生物的檢出，則認為是超標或異常檢驗結果，應立即啟動OOS調查。對于藥品檢驗機構而言，OOS調查即實驗室調查，包括影響檢驗結果的所有因素，如試驗人員、試驗方法、取樣程序、實驗設備、試驗器具、培養基、試驗環境等，隨著調查結果和流程，可以延伸到其他部門。對于生產企業而言，OOS調查包括實驗室調查和生產環節調查。實驗室調查包括上述內容，如果實驗室調查認為實驗結果有效，則應擴大調查至生產環節。一般來說，生產環節的調查包括檢出菌特性分析(包括來源、危害、耐受性、是否會產生生物膜等)、檢出菌的數量評估、檢出菌在物料或終產品中的生長特性分析、生產的某些工藝是否對檢出菌有抑制或殺滅作用、實驗檢出相同菌的歷史調查、生產過程的詳細分析(包括原輔料、水系統以及包裝材料的檢驗、物料的轉運、生產工藝參數、包裝)等；通過生產調查，根據調查結果進行風險評估判斷該產品是否放行，并查找根本原因，制訂糾正和預防措施。
 

　　參考：
 

　　[1] 《中國藥典》2020年版四部 1106 非無菌產品微生物限度檢查：控制菌檢查法；
 

　　[2] 《中國藥典》2020年版四部 9204微生物鑒定指導原則；
 

　　[3] 《中國藥品檢驗標準操作規范》2019年版。